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Hart Biologicals Ltd, 2 Rivergreen Business Centre, Queens Meadow, Hartlepool TS25 2DL. UK Tel: +44 (0) 1429-271100 Fax: +44 (0) 1429-277085 www.hartbio.com, E-mail: info@hartbio.com

ANWENDUNGSBEREICH

Das Kollagen-Reagenz von Hart Biologicals wird zur Diagnose von Störungen der Thrombozytenfunktion oder normaler Thrombozytenaktivität in plättchenreichem Humanplasma (PRP) oder Vollblut eingesetzt.

ZUSAMMENFASSUNG

Kollagen ist ein strukturelles Protein, das nahezu im gesamten menschlichen Körper vorzufinden ist. Während der primären Hämostase nach der Verletzung eines Blutgefäßes spielt die Adhäsion von Plättchen an exponiertes Kollagen an der Verletzungsstelle bei der Blutstillung an dieser Stelle eine Schlüsselrolle. Eine Beeinträchtigung der Fähigkeit der Plättchen, mit dem exponierten Kollagen zu interagieren, ist deshalb mögliche Ursache einer ungeklärten Blutungstendenz. Es gibt einige angeborene Störungen der Plättchenfunktion sowie einige erworbene und Arzneimittel-induzierte Wirkungen, die die durch Kollagen stimulierte Thrombozytenaggregation beeinflussen können. Die Untersuchung der Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten eines Patienten in einer kontrollierten Kollagenfibrillenpräparation ist ein wichtiger Teil der Untersuchung bei Verdacht auf Störungen der Plättchenfunktion.

Das Reagenz enthält eine lyophilisierte Präparation von 100 µg/ml Typ I (>95%) Kollagenfibrillen aus Pferdesehnen-Kollagen mit zugegebenen Stabilisatoren.

NACHWEISPRINZIP

Der Thrombozytenaggregationstest misst die Rate und das Ausmaß der Aggregation (Verklumpung) in einer plättchenreichen Plasmaprobe oder in antikoaguliertem Vollblut nach Zugabe einer Substanz, die in der Regel die Thromoyztenaggregation stimuliert (Agonist). In der optischen Aggregometrie hat die Verklumpung der Thrombozyten eine Abnahme der Trübung des plättchenreichen Plasmas zur Folge. Zur Messung wird ein Thrombozyten-Aggregometer verwendet, das die Rate und das maximale Ausmaß der Aggregationsreaktion graphisch aufzeichnet. In der Vollblut-Aggregometrie lagern sich Thrombozyten an Elektroden an, die in die Blutprobe eingetaucht werden. Die Impedanz zwischen den Elektroden während der Anlagerung und Aggregation der Thrombozyten wird gemessen und graphisch aufgezeichnet.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN

Nur für In-vitro-Diagnose. Nicht mit dem Mund pipettieren. Das Rauchen, Essen und Trinken ist in Bereichen, in denen Proben oder Kit-Reagenzien gehandhabt werden, untersagt. Beim Handling von Proben und Kit-Reagenzien Einweghandschuhe tragen. Anschließend Hände gründlich waschen.

MITGELIEFERTE MATERIALIEN

Kollagen-Reagenz

Inhaltsstoffe: Das Reagenz enthält eine lyophilisierte Kollagenfibrillenpräparation aus 100 μg/ml Pferdesehnen-Kollagen mit zugegebenen Stabilisatoren.

Reagenzpräparation: Jedes Fläschchen mit Kollagen-Reagenz sollte, wie auf dem Flaschenetikett angegeben, mit genau 1,0 ml gereinigtem oder deionisiertem Wasser rekonstituiert werden. 10 Minuten stehen lassen und vor Gebrauch gut mischen.

Lagerung und Stablität der Reagenzien: Das lyophilisierte Produkt sollte bei 2 - 8°C gelagert werden. Es ist bis zu dem aufgedruckten Verfallsdatum stabil. Nach der Rekonstitution ist das Produkt bei Raumtemperatur (20 - 25°C) für 8 Stunden, bei 2 - 8 °C für 2 Wochen oder bei -20°C für 4 Wochen stabil.

NICHT MITGELIEFERTE, ABER BENÖTIGTE MATERIALIEN

Plättchenaggregometriesystem – das Kollageneagenz von Hart Biologicals ist bei der Verwendung beliebiger Aggregometer zuverlässig. Befolgen Sie die Bedienungsanleitungen des Herstellers für das verwendete Aggregometer. Gereinigtes Wasser Pipetten für 1,0 ml

PROBENAHME UND PRÄPARATION²

Präparation von plättchenreichem und plättchenarmen Plasma für den optischen Aggregationstest

Das für den Thrombozytenaggregationstest benötigte Blut sollte in Kunststoffspritzen oder in Blutabnahmeröhrchen aus silikonisiertem Glas abgenommen und in Kunststoffröhrchen übertragen werden.

Das Blut (9 Anteile) mit 0,11 M oder 0,13 M Natriumcitratantikoagulans (1 Anteil) mischen. Behutsam drehen, um zu mischen. Nicht schütteln.

• Das plättchenreiche Plasma bei Raumtemperatur durch 10 – 15minütiges Zentrifugieren des antikoagulierten Blutes bei 150-200 x g präparieren.
• Das plättchenreiche Plasma mit einer Kunststoffpipette entnehmen und in einen Kunststoffbehälter (mit Stopfen) geben, der das Etikett ‘PRP’ trägt. Stopfen aufsetzen und Behälter auf Raumtemperatur halten.
• Das plättchenarme Plasma durch 20minütiges Zentrifugieren der restlichen Blutprobe bei 2000 x g präparieren.
• Das plättchenarme Plasma mit einer Kunststoffpipette entnehmen und in einen Kunststoffbehälter (mit Stopfen) geben, der das Etikett ‘PPP’ trägt. Stopfen aufsetzen und Behälter bei Raumtemperatur halten.
• Die Plättchenkonzentration im PRP-Behälter mit Hilfe des PPP auf 200-300 x 10⁹/L einstellen, Stopfen aufsetzen und vor dem Test 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
• Der Test sollte innerhalb von 3 Stunden nach der Blutabnahme abgeschlossen sein.

Präparation von Vollblutproben für den Aggregationstest

Bitte nehmen Sie Bezug zu den Empfehlungen des Herstellers des Aggregometers.

TESTVERFAHREN

A) Optische Aggregometrie

1. 0% und 100% Plättchen-Spiegel auf dem Aggregometer einstellen. Dazu plättchenarmes und plättchenreiches Plasma verwenden. Anweisungen des Geräteherstellers befolgen.
2. Das benötigte Volumen an plättchenreichem Plasma in eine Aggregationsküvette pipettieren und Stempel hinzufügen.
3. Das Plasma 120 Sekunden auf 37 °C vorwärmen.
4. Das benötigte Volumen Kollagen direkt in die Küvette geben. Vermeiden, dass das Reagenz seitlich an der Küvette herunterläuft.
5. Mindestens 5 Minuten warten, bis sich ein Aggregationsmuster gebildet hat.

B) Vollblut-Aggregometrie

Bitte nehmen Sie Bezug zu den Empfehlungen des Herstellers zur Ausführung des Tests.

QUALITÄTSKONTROLLE

Die Ergebnisse der Thrombozytenaggregationsuntersuchungen sollten mit den Ergebnissen von Aggregationsprofilen einer zur gleichen Zeit geprüften normalen Probe verglichen werden. Der normale Spender sollte in den vorausgegangenen 10 Tagen kein Aspirin oder aspirinhaltige Substanzen zu sich genommen haben. Ferner sollte er keine andere Medikation gegen Plättchenaggregation erhalten haben bzw. erhalten.

ERWARTETE WERTE ³,⁴

Nach Zugabe von Kollagen tritt zunächst eine Lag-Phase ein, in der keine Aggregation stattfindet. Normale Plättchen ändern nach der Lag-Phase ihre Gestalt, und es ist eine einzelne, große Aggregationswelle (60 – 80% der Gesamtaggregation) zu beobachten. Eine abnormale Aggregation kann die Lag-Phase, die Aggregationsrate und das maximale Aggregationsverhalten beeinträchtigen. Die erwartete Reaktion auf Kollagen bei den am häufigsten auftretenden Krankheitsbildern ist nachstehend aufgeführt:

WEITERE TESTS

Bei abnormalen Testergebnissen sollte der Test separat wiederholt werden. Wenn die Ergebnisse konsistent abnormal sind und der Patient keine Medikamente einnimmt, die unseren Kenntnissen zufolge die Plättchenfunktion beeinträchtigen, ist die Durchführung zusätzlicher Tests zu erwägen⁴.

EINSCHRÄNKUNGEN

Das Vorliegen von roten Blutzellen im PRP bewirkt eine Minderung der insgesamt beobachteten Aggregation. Das Vorliegen von Plättchen im PPP bewirkt eine Erhöhung der insgesamt beobachteten Aggregation. Falsche Ergebnisse sind festzustellen, wenn die Gesamtzahl der Plättchen im PRP unter 75 x 10⁹/L liegt. PRP, das weniger als 30 Minuten nach der Präparation getestet wird, kann abnormale Aggregationsprofile zeigen.

Literatur

1. Dacie & Lewis, ‘Practical Haematology’, Lewis, S.M., Bain, B.J. and Bates, I. (Editors); 9ᵗʰ Edition, Elsevier Science Ltd., 2002, pages 380-381.
2. Day, H.J. and Holmsen, H., ‘Laboratory Tests of Platelet Function’, Ann. Clin. Lab. Sci., 1972; 2 : 63.
3. Dacie & Lewis, ‘Practical Haematology’, Lewis, S.M., Bain, B.J. and Bates, I. (Editors); 9ᵗʰ Edition, Elsevier Science Ltd., 2002, pages 383-385.
4. Dacie & Lewis, ‘Practical Haematology’, Lewis, S.M., Bain, B.J. and Bates, I. (Editors); 9ᵗʰ Edition, Elsevier Science Ltd., 2002, pages 384-385.